大須賀 彩希（生物学科 4年生）^※

磯村 和志（生物科学専攻 修士課程1年生）^※

梶本 祥平（生物科学専攻 修士課程2年生）^※

小森 智貴（生物科学専攻 特任助教）

西増 弘志（生物科学専攻 助教）

島　 知弘（生物科学専攻 助教）

濡木　 理（生物科学専攻 教授）

上村 想太郎（生物科学専攻 教授）

発表のポイント

• ゲノム編集ツールとして近年注目を集めているCRISPR-Cas9の分子内の動きを観察する ことに成功した。
• 分子内で構造が揺らいでいるときと静止しているときがあること、および、揺らいでいる ときしかDNAを切断できる構造をとらないことを明らかにした。
• CRISPR-Cas9がDNAを切断する際の詳細な過程を解明したことにより、将来的なゲノム 編集のさらなる高効率化・正確性の向上などにつながることが期待される。

発表概要

東京大学大学院理学研究科の島助教・濡木教授らのグループは、ゲノム編集ツールとして近年注目を集めるDNA切断酵素CRISPR-Cas9の分子内の動きを、蛍光顕微鏡を用いて１分子レベルで可視化することに成功しました。Cas9がDNAを切断する一連の過程において、Cas9の分子構造はダイナミックに揺らいでいる状態と安定して静止した状態をとっており、ダイナミックに揺らいでいる状態でしかDNAが切断可能な構造状態をとらないことが明らかになりました。本研究結果は、CRISPR-Cas9によるDNA切断メカニズムの深い理解につながるものです。また今回の成果に基づき、構造変化のダイナミクスに着目してCRISPR-Cas9を改良することで、より効率的なゲノム編集技術構築に繋がることが期待されます。

発表内容

近年、遺伝情報を司るゲノムを直接改変する「ゲノム編集」が簡便に行える技術革新が起こり、広く注目を集めています。その中でもさまざまな塩基配列をもつDNAを選択的に切断することのできるCRISPR-Cas9^（注1)を用いたゲノム編集技術は、現在の生命科学分野において多岐に渡って応用展開されています。ゲノム編集時に、Cas9タンパク質はガイドRNAと結合して、ガイドRNAの一部配列と相補的な２本鎖DNAを切断する「はさみ」として働きます（図1）。

これまでに濡木教授らの研究グループを含む国内外の複数の研究グループにより構造解析が行われ、さまざまな条件におけるCRISPR-Cas9の構造が明らかとなりました。しかし、Cas9が実際にDNA切断酵素として働いている水溶液中での構造や、一連の構造が変化していく際の動き（ダイナミクス）は解明されていませんでした。昨年、西増助教・濡木教授らは高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を用いてDNA切断に伴うCas9分子のダイナミクスの一端を明らかにしました。今回、島助教を中心とした本研究グループは、１分子のCas9の分子内構造変化をより高い時間・空間分解能で可視化できる１分子蛍光共鳴エネルギー移動（１分子FRET^（注2)）法を用いることで、Cas9がDNAを切断する一連の過程において「はさみ」として働く部分（HNHドメイン）の構造変化ダイナミクスを実時間でより詳細に可視化することに成功しました。

Cas9のHNHドメインの動きに注目すると、主にFRET効率が低い状態で安定して静止していることが判明しました。これは、HNHドメインがDNA鎖から離れた位置にあることを示しています。我々はこのHNHドメイン位置を「中間位置（I position）」と名付けました。一方で少数のCas9分子内では、HNHが中間位置とよりDNA鎖に近い位置の間で揺らいでいる様子が観察され、この位置のことを「プレ切断位置（D* position）」と名付けました。つぎにDNA切断反応を引き起こすマグネシウムイオンを添加し、DNA切断時のCas9におけるHNHドメインの動きを観察したところ、より高頻度でHNHドメインが分子内で揺らぐことが明らかになりました。このとき、HNHドメインはプレ切断位置よりもさらにDNA鎖に近い位置にまで移動し、３状態間での構造揺らぎ^（注3)を示すようになりました。この最もDNA鎖に近いHNHドメイン位置を「切断位置（D positon）」と名付けました。興味深いことに、HNHドメインが切断位置にあるCas9は、構造がダイナミックに揺らいでいる時にのみ観察されました。これらの実験結果から、Cas9は分子内で構造が揺らいでいる時にのみDNA切断が可能であり、分子内の構造ダイナミクスがCas9のDNA切断活性において非常に重要な役割を果たしていることが明らかとなりました（図2）。

本研究は、Cas9がDNAを切断する一連の過程において、Cas9の分子構造はダイナミックに揺らいでいる状態と安定して静止した状態をとっており、ダイナミックに揺らいでいる状態でしかDNAが切断可能な構造状態をとらないことを、１分子FRET法を用いて明らかにしました。本研究成果によりCas9のDNA切断活性における「はさみ」部分の構造変化の重要性が解明されたことから、今後はこの構造変化に着目してCRISPR-Cas9を改良することで、より効率的なゲノム編集技術の構築に繋がることが期待されます。

本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業（課題番号: 15K18514 研究代表者: 島知弘; 課題番号: 17K15100 研究代表者: 小森智貴）、科学技術振興機構（JST） 戦略的創造研究推進事業　CREST「革新的1分子計測技術によるRNAサイレンシング機構の可視化：基盤作出と応用展開」（課題番号: JPMJCR14W1 研究代表者：上村想太郎）の支援を受けて行われました。

^{※ 研究当時}

発表雑誌

雑誌名	The EMBO Journal（オンライン版：4月17日）
論文タイトル	Real-time observation of flexible domain movements in CRISPR-Cas9
著者	Saki Osuka, Kazushi Isomura, Shohei Kajimoto, Tomotaka Komori, Hiroshi Nishimasu, Tomohiro Shima*, Osamu Nureki*, Sotaro Uemura
DOI番号	10.15252/embj.201796941
論文URL	http://emboj.embopress.org/cgi/doi/10.15252/embj.201796941

 

用語解説

注1 CRISPR-Cas9

原核生物の持つCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）と呼ばれるDNA配列、および、CRISPR関連タンパク質Cas（CRISPR-associated proteins）の一種であるCas9によって構成される獲得免疫機構。CRISPR-Cas9の利用により、効率的なゲノム編集が可能となった。↑

注2 FRET

2つの蛍光色素の距離が近いときに、1方の色素が得たエネルギーが他方の色素に遷移する現象。2つの蛍光色素の距離が近づくほど、FRET効率が高くなる。この現象はナノメートル(10^-9 m)レベルでの色素間の距離変化に鋭敏に呼応するため、ナノスケールの“分子ものさし”として広く利用されている。↑

注3 構造揺らぎ

タンパク質内の一部分または複数の領域が、特定の一か所に固定されず揺れ動くこと。これにより、タンパク質全体の構造が変化することになる。↑

―東京大学大学院理学系研究科・理学部 広報室―